荧光蛋白的发现与发展极大地推进了生命科学的研究进程，众多科学家通过遗传突变的方法不断提升荧光蛋白的理化性质，拓展其应用边界。近红外电磁波在生物系统中具备穿透深、背景信号低以及光毒性小的优点，因此高性能近红外荧光蛋白是深层组织与活体成像领域的关键需求。然而，在将荧光蛋白光谱进一步向近红外波段拓展的探索过程中，无论是类GFP型近红外荧光蛋白还是基于光敏色素的近红外荧光蛋白的亮度上限受到了天然氨基酸种类和内源性生色物质的限制，难以取得进一步突破（量子产率＜0.2）。在此背景下，兼具荧光蛋白可遗传编码特性与小分子荧光团高亮度优点的荧光遗传学工具成为新的研究热点。现有荧光遗传学工具（如HaloTag或SNAP-tag结合硅罗丹明）在一定程度上克服了红外波段亮度低的缺点，但仍存在蛋白质标签尺寸较大（HaloTag约36 kDa）、荧光染料双光子激发亮度低等不足。因此，开发一种兼具小尺寸和高亮度的新型近红外荧光蛋白具有重要意义。
近日，上海交通大学生物医学工程学院朱麟勇教授团队与华东理工大学杨弋教授、陈显军教授团队在近红外荧光激活蛋白的研究中取得突破性进展，在国际方法学权威学术期刊《Nature Methods》发表题为“NirFAP680: a highly bright and stable large Stokes shift near-infrared fluorogen-activating protein” 的研究论文。该研究采用荧光生色团与蛋白质标签共进化策略开发了新型近红外荧光激活蛋白NirFAP680，其不仅满足了超分辨、活体成像系统对高亮度近红外荧光蛋白的需求，同时为基于FRET、BRET原理的生物分析系统提供了具有超高灵敏度的平台。
研究团队首先以GFP生色团为基础，设计了一种新型近红外荧光生色团HBMT，该分子兼具尺寸小、量子产率高、光稳定性好以及斯托克斯位移大等优点。随后，研究团队通过定向进化获得了仅由116个氨基酸组成、对HBMT高亲和（Kd = 20 nM）且能大幅激活其荧光的蛋白标签NirFAP，成功构建出兼具高亮度与高稳定性的新型近红外荧光激活蛋白 NirFAP680。NirFAP680激发峰574 nm、发射峰680 nm，斯托克斯位移106 nm，量子产率高达0.56。该荧光激活蛋白信噪比高且对pH耐受，能够实现活细胞不同亚细胞定位蛋白的高信噪比成像。
与同波段荧光标签相比，NirFAP680 具有更小的尺寸，其分子量约为 miRFP与HaloTag的1/3、为类GFP型荧光蛋白的 1/2，这将极大地降低对所标记蛋白的扰动。活细胞亮度测试结果显示，NirFAP680在单光子激发时的细胞内亮度相较于其他荧光标签实现了至少一个数量级的提升。双光子测试结果显示，NirFAP680 的双光子吸收截面大于mCardinal和HaloTag-SiR，其在活细胞中较广泛应用的近红外标签HaloTag-SiR具有更高的双光子激发亮度。
连续成像结果表明，NirFAP680在单、双光子激发时均具有优异的光稳定性，其光稳定性可与HaloTag-SiR 相媲美，连续激发10分钟后荧光强度仅发生微弱下降，相比之下同类型荧光标签frFAST在前10秒荧光强度便出现了大幅度下降。基于上述小尺寸、高亮度及优异光稳定性的特点，NirFAP680 成功应用于活细胞微管、微丝等多种亚细胞结构的超分辨成像，且可连续捕获超过100帧的STED图像。
在优异的光学性能之外，NirFAP680还具有良好的生物相容性。NirFAP680对斑马鱼受精卵的发育无影响，可成功实现对斑马鱼发育动态长达数小时的持续追踪。出众的双光子激发亮度使其可实现活体斑马鱼神经系统的可视化。与此同时，本研究验证了NirFAP能够在小鼠大脑中广泛且高效地表达，HBMT在小鼠大脑中具有良好的组织渗透性。因此，NirFAP680可用于活体小鼠神经网络结构的可视化。上述结果表明NirFAP680在解决深层组织与复杂神经环路高分辨成像方面具有极高的应用价值。
得益于小尺寸与大斯托克斯位移特性，NirFAP680在构建荧光共振能量转移（FRET）与生物发光共振能量转移（BRET）体系中展现出极大潜力。本研究将 NirFAP680 与 LSSmOrange 结合，构建了斯托克斯位移达 243 nm 的FRET对。该体系有效避免了光谱串扰，成功实现了对活细胞中药物诱导蛋白质相互作用及钙离子动态的高灵敏度监测。另一方面，通过NirFAP680 与高亮度青色萤光素酶NanoLuc 的结合，本研究开发出高亮度的BRET型近红外发光蛋白 NirNL，其在活体小鼠深层组织中的发光强度显著优于基于传统荧光蛋白构建的BRET型发光蛋白 Antares。得益于极低的供体发光信号干扰，该BRET系统在检测药物诱导蛋白质相互作用时信噪比超过 300 倍，远超以传统荧光蛋白为能量受体的BRET系统，为蛋白互作研究提供了超高灵敏的检测工具。
综上所述，本研究开发了兼具小尺寸、高亮度和大斯托克斯位移的新型近红外荧光激活蛋白 NirFAP680，全面实现了从活细胞超分辨成像、活体深层组织双光子成像，到基于 FRET/BRET 原理的蛋白质互作和信号通路动态的超高灵敏监测。该工作突破了传统近红外荧光标签的技术局限，为未来高性能光学探针的设计提供了可靠的方法学范式。
上海交通大学生物医学工程学院陈政达和蒋丽博士后为本文共同第一作者，上海交通大学朱麟勇教授与华东理工大学杨弋教授、陈显军教授为本文共同通讯作者。
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